液体活检，目前主要用于癌症不同阶段的筛查和治疗。即使在无症状人群中，它也可以有效识别出癌症早期患者，这一特点使之成为标准肿 瘤检测中重要的非侵入性辅助方法。
Cell-free DNA
液体活检中应用很广泛的分析指标是外周血游离 DNA（cfDNA）。此外，还包括其他体液系统中肿 瘤释放的 cfNA（cfDNA、cfRNA 等）。cfDNA 就是游离于细胞外的 DNA，它即包含 ctDNA（circulating tumor DNA）也包括来自于正常细胞的 DNA 碎片。例如，脑脊液、唾液、尿液、胸腔和腹腔积液、粪便等，都是 cfDNA 的潜在来源，上述样本经 cfDNA 富集可用于不同类型癌症的检测。在健康个体中，cfDNA 来源于正常的细胞更新，而在癌症患者中 cfDNA 含量会升高，cfDNA 长度约为 167bp，半衰期不足 1 小时。
DNA 甲基化
表观遗传学信息如甲基化或蛋白质生物标记物结合 ctDNA 已被证明有助于早期确定肿 瘤的起源。研究人员发现，来自甲基化组数据的肿 瘤和组织特异性模式有助于疾病分类。肿 瘤 DNA 甲基化谱与血浆 ctDNA 甲基化谱高度相关，可用于乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌等疾病的诊断和预后判断。然而，与 DNA 变异检测类似，cfDNA 中 DNA 甲基化变化程度变化和低起始量，对检出技术的覆盖率、成本和灵敏度提出了挑战。
Cell-free DNA 甲基化的临床应用
▶ 癌症筛查与早诊
在无症状人群中，液体活检可以用于癌症患者的识别，以提高早期诊断和更好的干预。研究表明，肿 瘤 DNA（ctDNA）可用于早期肺癌诊断（I 期或 II 期），具有较高的敏感性和特异性。除了 DNA 突变，DNA 甲基化和 cfDNA 水平的量化可以结合起来提供稳健和一致的结果。SEPT9 基因甲基化检测是通过美国食品与药物管理局（FDA）批准的结肠直肠癌（CRC) 血液筛查试验，与蛋白质标记物相比，具有更高的敏感性和特异性。我国食品和药品监督管理局今年也首批了一款结直肠癌早筛产品，通过结合基因突变、甲基化检测和便隐血测试，临床结果显示，在 4245 例结直肠癌高风险人群中，171 例阳性患者终被确诊为结直肠癌，筛查灵敏度达到 91.1%。
▶ 微小病灶残留和复发风险评估
微小病灶残留（MRD) 是手术或治疗后肿 瘤复发的主要原因。不幸的是，目前还没有有效的方法来鉴别 MRD 和复发。此外，用于复发风险分层的常规临床或病理参数不足以准确指导辅助治疗，导致患者在大部分患者已治愈且不需要此类潜在有害治疗的情况下，仍不得不接受不加区分的治疗。已经证实，ctDNA 甲基化标记物可以提示 MRD 的存在，即使在没有其他临床疾病证据的情况下，也可以识别复发风险高的患者。将患者分为高风险组和低风险组将使可能受益大的患者能够接受辅助治疗，同时使低风险患者免于不必要的合并症和不良事件的风险。近期，一项前瞻性临床试验评估了 II 和 III 期 CRC 患者术后 ctDNA 标志物（WIF1 和 NPY) 与肿 瘤复发的关系。采集 805 例 II-III 期 CRC 患者术前和术后的血浆样本（NCT00958737)。在手术切除后随访时，采用 ddPCR 检测 WIF1 和 NPY 在 ctDNA 甲基化情况。作者观察到，ctDNA 阴性组 2 年无病生存率显著高于 ctDNA 阳性组（82% vs 64%)，这表明 ctDNA 甲基化分析可以用于预测微小病灶残留的病变。
▶ 治疗选择和预后
cfDNA 的半衰期较短，可以与肿 瘤细胞状态直接相关，从而为治疗期间持续动态观察监测癌症负担提供了可能性。有研究表明 ctDNA 动力学与治疗反应相关。例如，血清的 MGMT 的甲基化水平与原发组织高度，在 cfDNA 中检测 MGMT 的甲基化水平能够预测胶质细胞瘤患者在细胞毒性治疗后的响应时间和进展。一项前瞻性研究验证了乳腺癌甲基化特异性 PCR cfDNA 检测方法，该方法针对 6 个癌症相关启动子的 CGI 来监测治疗反应。这 6 个位点的累积甲基化得分与转移性乳腺癌患者的生存结果显著相关。
▶ ctDNA 的组织溯源追踪
目前除了使用 ctDNA 作为液体活检来检测癌症的兴趣之外，它也可以用于 ctDNA 的起源和肿 瘤的定位。事实上，在每一种肿 瘤组织和每一种组织中都有独特的 DNA 甲基化谱。因此，甲基化谱的差异可以识别 ctDNA 来源的组织。据报道，近期一项研究开发了组织特异性 DNA 甲基化生物标志物，利用基于数字 PCR 的方法测量肝脏和结肠源 DNA 的血浆浓度，并探索其在转移性 CRC 研究中的临床应用。结果证实了肝脏特异性标记物在反映血浆中肝脏源性 DNA 浓度方面的准确性（检测 HCC 的特异性为 93%，敏感性为 60%)。肝源性 DNA 的绝 对 浓 度有助于有无肝转移的 CRC 患者提供了更好的区分。这些结果表明，ctDNA 甲基化有助于肿 瘤发生的组织溯源。
Cell-free DNA 甲基化的研究方法
参考文献：
[1] Luo H, Wei W, Ye Z, et al. Liquid Biopsy of Methylation Biomarkers in Cell-Free DNA [J]. Trends Mol Med, 2021, 27(5): 482-500.
[2] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the Early Detection of Cancer by Decoding the Epigenetic and Environmental Fingerprints of Cell-Free DNA [J]. Cancer Cell, 2019, 36(4): 350-68.
